تست آنتی بیوگرام چیست ؟

آنتی بیوگرام ، به عنوان تستی حیاتی در دنیای میکروبیولوژی می باشد . این تست با هدف ارزیابی حساسیت یا مقاومت میکروارگانیسم های بیماری زا در برابر آنتی بیوتیک های مختلف طراحی شده است که دارای انواع گوناگون می باشد . اهمیت آنتی بیوگرام ها در دنیای امروز، به ویژه با توجه به افزایش روزافزون مقاومت آنتی بیوتیکی ، بیش از پیش آشکار شده است . انتخاب آنتی بیوتیک مناسب  به ریشه کن کردن عفونت ها و بیماری ها کمک زیادی بکند . در این قسمت قرار است تست انتی بیوگرام را از جهات مختلفی مورد بررسی خود قرار دهیم .

تاریخچه تست آنتی بیوگرام

مفهوم ارزیابی حساسیت میکروارگانیسم ها به مواد ضد میکروبی ریشه در اوایل قرن بیستم دارد . الکساندر فلمینگ در سال ۱۹۲۸   پنیسیلین را کشف کرد و سپس با تولید انبوه آن در طول جنگ جهانی دوم سبب شد تا نیاز به روش هایی برای تعیین اثربخشی این دارو و سایر آنتی بیوتیک های نوظهور در برابر باکتری های مختلف احساس بشود .

اولین روش های ارزیابی حساسیت به صورت کیفی بودند . روش دیسک دیفیوژن ، یکی از روش های اولیه ای بود که بعد ها توسط کربی و باور در سال ۱۹۶۶ استاندارد سازی شد و به “روش کربی و باور” معروف گردید . در این روش ، دیسکهای کاغذی آغشته به غلظت مشخصی از آنتی بیوتیک بر روی سطح یک محیط کشت حاوی باکتری مورد نظر قرار داده میشدند . اندازه ناحیه عدم رشد در اطراف دیسک ، نشان دهنده حساسیت یا مقاومت باکتری به آن آنتی بیوتیک بود.

با گذشت زمان و پیشرفت های صورت گرفته در حوزه میکروبیولوژی، نیاز به روش های کمی تری برای تعیین حساسیت احساس شد. این نیاز منجر به توسعه روش هایی برای تعیین “حداقل غلظت مهار (MIC) گردیدکه معنی ان میشود کمترین غلظتی که یک آنتی بیوتیک که می تواند رشد قابل مشاهده یک باکتری را مهار کند .

در دهه های اخیر ، با پیشرفت تکنولوژی ، روش های اتوماتیک و نیمه اتوماتیک برای انجام آنتی بیوگرام ها توسعه یافته اند . این سیستم ها از تکنولوژی های گسترده ای مانند فتومتری و توربیدومتری بهره میبرند که امکان انجام سریع تر و دقیق تر تست ها را فراهم میکنند .

انواع تست های آنتی بیوگرام

همانطور که در بخش تاریخچه اشاره شد ، آنتی بیوگرام ها به روشهای مختلفی انجام می شوند که هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند :

تست دیسک دیفیوژن (Disk Diffusion Test) :

این روش با کشت سوسپانسیون باکتری به روش چمنی بر روی محیط کشت اماده شده از قبل اغاز میشود و در ادامه با قرار دادن دیسک های آنتی بیوتیک بر روی ان به شیوه استاندارد کار را جلو می بریم . پس از گذشت مقدار زمان لازم اندازه منطقه عدم رشد نشان دهنده حساسیت است . این روش یک روش ساده ، کم هزینه و مناسب برای آزمایشگاه ها میباشد اما از معایب این روش میتوان به دقت کم اشاره کرد .  

تست حداقل غلظت مهاری (MIC)

MIC تعیین کمترین غلظت آنتی بیوتیک که از رشد قابل مشاهده باکتری جلوگیری میکند . این روش در براث آگار انجام میتواند گردد . این روش اطلاعات ارزشمندی را برای انتخاب دوز آنتی بیوتیک به ما خواهد داد اما این روش  زمان برتر از دیسک دیفیوژن است و نیاز به لوازم بیشتری دارد .

تست حداقل غلظت کشنده (MBC)  

تعیین کمترین غلظت آنتیبیوتیک که %۹۹.۹ از جمعیت باکتریایی اولیه را از بین میبرد . معموالً پس از تعیین MIC در براث انجام میشود . این روش اطلاعاتی در مورد اثر کشندگی آنتیبیوتیک به ما ارائه میدهد و نه صرفا مهار رشد اما از معایب میتوان به این اشاره کرد که زمان برتر و مقداری پیچیده تر از MIC است .

روشهای اتوماتیک و نیمه اتوماتیک

استفاده از سیستم های خودکار که معمولا اصول کارشان بر پایه تکنولوژی میکرو براث دیلوشن در پلیت های ۹۶ چاهکی یا کارتریج های مخصوص هستند . دستگاه به طور خودکار کدورت نشان دهنده رشد باکتری  را در حضور غلظت های مختلف آنتی بیوتیک اندازه گیری کرده و MIC را تعیین و تفسیر میکند . این روش یک روش بسیار مناسب است زیرا که در زمان و دقت و تولید داده ها صرفه جویی بالایی انجام میدهد اما باید همیشه این روش را مورد بررسی قرار داد زیرا که ممکن است از خود خطا نشان دهد .

 روش  Etest

ترکیبی از روش دیسک دیفیوژن و رقت سریالی است . یک نوار پالستیکی با گرادیان غلظتی از آنتی بیوتیک بر روی سطح آگار تلقیح شده با باکتری قرار داده میشود.  این روش هزینه بالاتری نسبت به دیسک دیفیوژن دارد .

روش انجام تست های آنتی بیوگرام

انجام آنتی بیوگرام ها یک فرآیند چند مرحله ای است که دقت در هر مرحله برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد ضروری است . مراحل کلی شامل موارد زیر است :

نمونه گیری و جداسازی میکروارگانیسم :

اولین گام ، به دست آوردن نمونه مناسب از محلی که باکتری حضور دارد است و سپس جداسازی ان گام دوم است . محیط های کشت مناسب کشت داده میشوند تا باکتری ها رشد کرده و کلنی های خالص به دست آیند . شناسایی دقیق باکتری مورد نظر نیز یک مرحله مهم است که معمولا قبل یا همزمان با آنتی بیوگرام انجام میشود .

تهیه سوسپانسیون میکروبی :

از کلنی های خالص باکتریایی ، یک سوسپانسیون با کدورت مشخص تهیه میشود (مانند مک فارلند ) .  تلقیح محیط کشت و قرار دادن آنتی بیوتیک ها بسته به نوع آنتی بیوگرام ، سوسپانسیون میکروبی تهیه شده به روش های مختلفی تلقیح میشود:

در روش دیسک دیفیوژن : سوسپانسیون میکروبی به طور یکنواخت (چمنی) بر روی سطح یک محیط کشت جامد معمولا مولر-هینتون آگار پخش میکنیم . سپس دیسک  های کاغذی حاوی آنتی بیوتیک های مختلف بر روی سطح آگار به روش استاندارد  قرار داده میشوند

در روش MIC : سوسپانسیون میکروبی به لوله ها یا چاهک های حاوی رقت های سریالی آنتی بیوتیک در محیط کشت براث تلقیح میشود.

در روش های اتوماتیک : سوسپانسیون میکروبی به داخل کارتریج ها یا پلیت های مخصوصی که حاوی آنتی بیوتیک ها در غلظت های مختلف هستند ، تلقیح میشود .

انکوباسیون :

پس از تلقیح و قرار دادن دیسک ها ، پلیت ها ،  لوله ها یا کارتریج ها در شرایط مناسب معمولا دما و شرایط بهینه و استاندارد و زمان مناسب که معمولا ۲۴ الی ۱۶ ساعت  انکوبه میشوند تا باکتری ها رشد کنند و اثر آنتی بیوتیک ها مشخص شود .

خوانش و تفسیر نتایج

نحوه خوانش و تفسیر نتایج بستگی به نوع آنتی بیوگرام دارد :

در روش دیسک دیفیوژن : قطر ناحیه عدم رشد در اطراف هر دیسک اندازه گیری میشود . این قطر بر اساس دستورالعمل های استاندارد مانند CLSI بررسی میشود . تا حساسیت (S) و مقاومت (R) و یا حساسیت وابسته به دوز (I) باکتری به آن آنتی بیوتیک تعیین شود.

در روش رقت های سریالی :  کمترین غلظت آنتیبیوتیک که از رشد قابل مشاهده باکتری جلوگیری میکند، به عنوان MIC تعیین میشود.  

در روش های اتوماتیک : دستگاه به طور خودکار رشد باکتری را در حضور غلظت های مختلف آنتیبیوتیک اندازه گیری کرده و MIC را محاسبه میکند . سپس دستگاه نتایج را بر اساس پایگاه داده داخلی و دستورالعمل های استاندارد تفسیر کرده و وضعیت حساسیت R  و I و S  را گزارش میدهد .

در آزمایشگاه رشد ازما میتوانید انواع تست های انتی بیوگرام را فرا گرفته و در پروژه های خود استفاده بنمائید

منابع

Clinical Infectious Diseases/  LifeLabs/ BIOMIC /MedlinePlus ScienceDirect/ National Institutes of Health /EUCAST Clinical & Laboratory Standards Institute/ Minnesota Department of Health