آشنایی با تست MTT

تست MTT با هدف بررسی میزان سمیت داروها و یا ترکیبات مختلف روی سلول‌ها و همچنین بررسی میزان زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها مورد استفاده محققین قرار می‌گیرد. این تست یک روش رنگ‌سنجی است که در آن می‌توانیم نتایج تست را به‌صورت کیفی از روی طیف رنگی بنفش تا صورتی کم‌رنگ یا سفید تشخیص دهیم. این تست درون میکروپلیت‌های 96 خانه و همراه با تکرار انجام می شود که نتیجه آن افزایش دقت و حساسیت آزمایش است.

رنگ MTT:

رنگ MTT، مخفف واژه دی متیل تیازول تترازولیم بروماید (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)، یک ترکیب پودری و زرد رنگ می‌باشد که از شرکت‌های سازنده خریداری و سپس در محلول PBS حل می‌شود. به‌منظور استفاده در فرایند تست، محلول MTT به نسبت 5% یا 10% با محیط کشت سلولی ترکیب می‌شود. این رنگ زمانی که در معرض سلول‌ها قرار می‌گیرد، با آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری سلول‌ها واکنش می دهد و بلورهای بنفش‌رنگ فرومازان تشکیل می شوند.

مراحل تست MTT:

این تست دارای سه مرحله Seeding, Treating, Reading می‌باشد که هر کدام در یک روز جدا انجام می شوند و بسته به نوع رده سلولی، نوع دارو و هدف تست، روز خوانش را می‌توانیم 24، 48، 72 یا 96 ساعت پس از تیمار سلول‌ها با دارو انجام بدهیم.

Seeding MTT:

در اولین روز تست ما باید سلول‌های مورد نظرمان را درون پلیت مخصوص کشت دهیم. به این منظور ابتدا باید یک مرحله شمارش سلولی انجام دهیم تا از داشتن تعداد سلول مورد نیاز اطمینان حاصل کنیم. در هر چاهک یا خانه از پلیت 96 خانه، می توانیم حدود 10 هزار سلول کشت دهیم و حجم کل محیطی که در هر چاهک جای می گیرد نیز 200 میکرولیتر می باشد؛ که در روز اول سلول ها را به همراه 100 میکرولیتر محیط کشت می دهیم.

بنابراین بسته به تعداد سلول موجود و مورد نیاز برای تست، محلول استوک سلولی خود را آماده می کنیم. سپس در هر چاهک پلیت، 100 میکرولیتر از آن را کشت می دهیم. با توجه به نوع رده سلولی، اگر سلول ها چسبنده باشند، باید حداقل 24 ساعت در انکوباتور نگهداری شوند و به آنها زمان بدهیم تا به کف چاهک های پلیت متصل شوند و سپس به سراغ مرحله دوم تست برویم.

Treating MTT:

به‌منظور تیمار سلول‌ها در روز دوم، ابتدا باید برای داروی خود تعیین دوز کنیم و غلظت‌های مورد نظر را مشخص کنیم. درصورتی‌که داروی ما ترکیب جدیدی نباشد و IC50 آن در مقالات موجود باشد، می‌توانیم برای حداکثر غلظت دارو از آن استفاده کنیم. اما اگر دارو ترکیب جدیدی است که تابه‌حال کار نشده، بهترین محدوده غلظت برای سلول‌های سرطانی بین 0 تا 1000 g/mlµ می‌باشد. تعداد غلظت‌های انتخابی به روش کشت دادن سلول‌ها در روز اول وابسته است. اگر کشت به صورت عمودی باشد، 8 غلظت، و اگر به صورت افقی باشد، می‌توانیم 12 غلظت دارو را استفاده کنیم.

در نهایت پس از انجام محاسبات دوزیابی دارو و تهیه محلول استوک، غلظت‌های مناسب برحسب µl/well را به ترتیب از کمترین مقدار یعنی 0 تا بیشترین مقدار روی سلول‌ها اضافه می کنیم و حجم محلول هر چاهک را با استفاده از محیط کشت کامل به 100 میکرولیتر می‌رسانیم. به‌این‌ترتیب 100 میکرولیتر دوم را نیز همراه دارو اضافه می کنیم و حجم 200 میکرولیتری چاهک‌ها پر می‌شود.

Reading MTT:

در روز سوم، به منظور بررسی نتیجه تست، اولین قدم حذف محیط رویی هر چاهک می‌باشد که حاوی محیط کشت مصرفی و دارو است. سپس محلول رنگ MTT را به مقدار 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه می کنیم و برای انجام واکنش، بین 30 دقیقه تا 4 ساعت پلیت را درون انکوباتور قرار می‌دهیم. پس از گذشت زمان لازم، بلورهای فرومازان تشکیل می شوند، بنابراین رنگ اضافه را خارج کرده و برای محلول کردن بلورها، به هر چاهک 100 میکرولیتر از ترکیب DMSO اضافه می‌کنیم.

در پایان پلیت را درون دستگاه الایزا یا Microplate reader قرار می دهیم و در طول موج مناسب خوانش می‌کنیم. نتایج به‌دست‌آمده از دستگاه به‌صورت اعداد جذب نوری یا OD (Optical Density) گزارش می‌شوند که باید برای به‌دست‌آوردن IC50 دارو و بررسی کمی، در نرم‌افزار مناسب مانند GraphPad آنالیز آماری شوند.

انجام تست MTT در آزمایشگاه رشدآزما:

در این مطلب ما تلاش کردیم تا شما را با اساس کلی تست MTT آشنا کنیم. شما می‌توانید در صورت نیاز به انجام این تست و یا آموزش کامل و عملی با نازل‌ترین قیمت، با کارشناسان ما در رشدآزما در ارتباط باشید.